色譜流動相(xiàng)調整，你是咋調的？

來源：本站整理發布時間：2020.04.17 浏覽：4166 次

“小(xiǎo)王昨天的分離度不太行呀，流動相(xiàng)要再調調！”這話是不是很熟悉？調調？！咋調？如果你還(hái)不知道如何配置合适的流動相(xiàng)瞅這裡(lǐ)！

秘訣1：由強到(dào)弱

一(yī)般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(shuǐ)(或緩沖溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到(dào)分離結果，然後根據出峰情況調整有機(jī)溶劑(乙腈或甲醇)的比例。

秘訣2：三倍規則

每減少10%的有機(jī)溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為(wèi)三倍規則。這是一(yī)個(gè)聰明而又(yòu)省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個(gè)峰的分離情況。

秘訣3：粗調轉微調

當分離達到(dào)一(yī)定程度，應将有機(jī)溶劑10%的改變量調整為(wèi)5%，并據此規則逐漸降低(dī)調整率，直至各組分的分離情況不再改變。

1．流動相(xiàng)的性質要求一(yī)個(gè)理想的液相(xiàng)色譜流動相(xiàng)溶劑應具有低(dī)粘度、與檢測器(qì)兼容性好、易于得到(dào)純品和低(dī)毒性等特征。

選擇流動相(xiàng)時應考慮以下(xià)幾個(gè)方面：

①流動相(xiàng)應不改變填料的任何性質。低(dī)交聯度的離子交換樹脂和排阻色譜填料有時遇到(dào)某些有機(jī)相(xiàng)會(huì)溶脹或收縮，從(cóng)而改變色譜柱填床的性質。堿性流動相(xiàng)不能(néng)用于矽膠柱系統。酸性流動相(xiàng)不能(néng)用于氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱系統。

②純度。色譜柱的壽命與大量流動相(xiàng)通(tōng)過有關，特别是當溶劑所含雜(zá)質在柱上(shàng)積累時。

③必須與檢測器(qì)匹配。使用UV檢測器(qì)時，所用流動相(xiàng)在檢測波長(cháng)下(xià)應沒有吸收，或吸收很小(xiǎo)。當使用示差折光(guāng)檢測器(qì)時，應選擇折光(guāng)系數與樣品差别較大的溶劑作流動相(xiàng)，以提高(gāo)靈敏度。

④粘度要低(dī)（應<2cp）。高(gāo)粘度溶劑會(huì)影響溶質的擴散、傳質，降低(dī)柱效，還(hái)會(huì)使柱壓降增加，使分離時間延長(cháng)。最好選擇沸點在100℃以下(xià)的流動相(xiàng)。

⑤對樣品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，樣品會(huì)在柱頭沉澱，不但影響了純化分離，且會(huì)使柱子惡化。

⑥樣品易于回收。應選用揮發性溶劑。

2．流動相(xiàng)的pH值

采用反相(xiàng)色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通(tōng)過調節流動相(xiàng)的pH值，以抑制樣品組分的解離，增加組分在固定相(xiàng)上(shàng)的保留，并改善峰形的技(jì)術(shù)稱為(wèi)反相(xiàng)離子抑制技(jì)術(shù)。對于弱酸，流動相(xiàng)的pH值越小(xiǎo)，組分的k值越大，當pH值遠(yuǎn)遠(yuǎn)小(xiǎo)于弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相(xiàng)反。分析弱酸樣品時，通(tōng)常在流動相(xiàng)中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通(tōng)常在流動相(xiàng)中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩沖液和30mmol/L三乙胺溶液。

注：流動相(xiàng)中加入有機(jī)胺可以減弱堿性溶質與殘餘矽醇基的強相(xiàng)互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下(xià)有機(jī)胺（如三乙胺）又(yòu)稱為(wèi)減尾劑或除尾劑。

(三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個(gè)乙基取代的産物(wù)。分子式(CH₃CH₂)₃N。易揮發的無色液體，有氨的氣味。熔點－114.7℃，沸點89.3℃，相(xiàng)對密度0.7275（20／4℃）。溶于水(shuǐ)和乙醇、乙醚等有機(jī)溶劑。三乙胺有堿性，與無機(jī)酸能(néng)生(shēng)成易溶于水(shuǐ)的鹽類。可由N，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁锂反應制取，也可用乙醇胺進行氣相(xiàng)烷基化反應合成。用于制橡膠硫化促進劑、潤濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用于合成四級铵化合物(wù)。)

3. 如何選擇緩沖液PH值在選擇緩沖液PH值之前，應先了解被分析物(wù)的Pka，高(gāo)于或低(dī)于Pka兩個(gè)PH值單位的，有助于獲得好的、尖銳的峰，從(cóng)HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高(gāo)于或低(dī)于Pka兩個(gè)單位，化合物(wù)中99％以一(yī)種形式存在，而一(yī)種形式存在的化合物(wù)才能(néng)獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物(wù)的轉變，苯甲酸的Pka等于4.2，理論上(shàng)由HH公示得知，當溶液PH值等于2.2時，99％的苯甲酸以中性化合物(wù)存在，PH值等于6.2時99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當緩沖液PH值等于2.2時，中性化合物(wù)以羧酸形式保留于反相(xiàng)柱，表1列出了一(yī)般緩沖液和他們的緩沖範圍。從(cóng)表1知磷酸鹽和檸檬酸鹽緩沖液能(néng)用于PH值等于2.2。

當化合物(wù)隻有氨基時，緩沖體系的選擇十分簡單，大多(duō)數氨基化合物(wù)在PH值小(xiǎo)于9時都被質子化，所以所有PH值在7或更低(dī)的溶液均适合應用，你也許會(huì)問水(shuǐ)的PH值大約是7，為(wèi)什麽還(hái)用緩沖鹽，因為(wèi)緩沖鹽有助于增加方法的可靠性，以及色譜峰的尖銳性，PH值的降低(dī)有助于氨基化合物(wù)保留的減弱，減小(xiǎo)化合物(wù)與矽膠表面矽羟基的作用，而使峰更尖銳，從(cóng)表1 可值，任何緩沖液均可應用于氨基化合物(wù)的分析，但我們認為(wèi)PH值等于3的磷酸鉀鹽最适合用于氨基化合物(wù)的分析。

在上(shàng)面兩個(gè)例子中，PH＝3的磷酸鉀鹽都能(néng)獲得良好的應用，在一(yī)般情況下(xià)，它是含羧基和氨基化合物(wù)分析中最好的緩沖液，并且我們認為(wèi)在氨基化合物(wù)分析中鉀鹽比鈉鹽更好。

4．流動相(xiàng)的脫氣

HPLC所用流動相(xiàng)必須預先脫氣，否則容易在系統内逸出氣泡，影響泵的工(gōng)作。氣泡還(hái)會(huì)影響柱的分離效率，影響檢測器(qì)的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。此外，溶解在流動相(xiàng)中的氧還(hái)可能(néng)與樣品、流動相(xiàng)甚至固定相(xiàng)（如烷基胺）反應。溶解氣體還(hái)會(huì)引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。溶解氧能(néng)與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物(wù)，此絡合物(wù)會(huì)提高(gāo)背景吸收（特别是在260nm以下(xià)），并導緻檢測靈敏度的輕微降低(dī)，但更重要的是，會(huì)在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光(guāng)檢測中，溶解氧在一(yī)定條件(jiàn)下(xià)還(hái)會(huì)引起淬滅現象，特别是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下(xià)，熒光(guāng)響應可降低(dī)達95%。在電(diàn)化學檢測中（特别是還(hái)原電(diàn)化學法），氧的影響更大。

除去流動相(xiàng)中的溶解氧将大大提高(gāo)UV檢測器(qì)的性能(néng)，也将改善在一(yī)些熒光(guāng)檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。

對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低(dī)沸點溶劑揮發造成的組成變化。

超聲脫氣比較好，10~20分鍾的超聲處理對許多(duō)有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑/水(shuǐ)混合液的脫氣是足夠了（一(yī)般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器(qì)内液面不要高(gāo)出水(shuǐ)面太多(duō)。

離線（系統外）脫氣法不能(néng)維持溶劑的脫氣狀态，在你停止脫氣後，氣體立即開(kāi)始回到(dào)溶劑中。在1~4小(xiǎo)時内，溶劑又(yòu)将被環境氣體所飽和。

在線（系統内）脫氣法無此缺點。最常用的在線脫氣法為(wèi)鼓泡，即在色譜操作前和進行時，将惰性氣體噴入溶劑中。嚴格來說，此方法不能(néng)将溶劑脫氣，它隻是用一(yī)種低(dī)溶解度的惰性氣體（通(tōng)常是氦）将空氣替換出來。此外還(hái)有在線脫氣機(jī)。

一(yī)般說來有機(jī)溶劑中的氣體易脫除，而水(shuǐ)溶液中的氣體較頑固。在溶液中吹氦是相(xiàng)當有效的脫氣方法，這種連續脫氣法在電(diàn)化學檢測時經常使用。但氦氣昂貴，難于普及。

5．流動相(xiàng)的濾過所有溶劑使用前都必須經0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜(zá)質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在标簽上(shàng)标明“已濾過”）。用濾膜過濾時，特别要注意分清有機(jī)相(xiàng)（脂溶性）濾膜和水(shuǐ)相(xiàng)（水(shuǐ)溶性）濾膜。有機(jī)相(xiàng)濾膜一(yī)般用于過濾有機(jī)溶劑，過濾水(shuǐ)溶液時流速低(dī)或濾不動。水(shuǐ)相(xiàng)濾膜隻能(néng)用于過濾水(shuǐ)溶液，嚴禁用于有機(jī)溶劑，否則濾膜會(huì)被溶解！溶有濾膜的溶劑不得用于HPLC。對于混合流動相(xiàng)，可在混合前分别濾過，如需混合後濾過，首選有機(jī)相(xiàng)濾膜。現在已有混合型濾膜出售。6．流動相(xiàng)的貯存流動相(xiàng)一(yī)般貯存于玻璃、聚四氟乙烯或不鏽鋼容器(qì)内，不能(néng)貯存在塑料容器(qì)中。因許多(duō)有機(jī)溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑劑，導緻溶劑受污染。這種被污染的溶劑如用于HPLC系統，可能(néng)造成柱效降低(dī)。貯存容器(qì)一(yī)定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相(xiàng)。

磷酸鹽、乙酸鹽緩沖液很易長(cháng)黴，應盡量新鮮配制使用，不要貯存。如确需貯存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前應重新濾過。容器(qì)應定期清洗，特别是盛水(shuǐ)、緩沖液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜(zá)質沉澱和可能(néng)生(shēng)長(cháng)的微生(shēng)物(wù)。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。

7．鹵代有機(jī)溶劑應特别注意的問題鹵代溶劑可能(néng)含有微量的酸性雜(zá)質，能(néng)與HPLC系統中的不鏽鋼反應。鹵代溶劑與水(shuǐ)的混合物(wù)比較容易分解，不能(néng)存放(fàng)太久。鹵代溶劑（如CCl₄、CHCl₃等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合後，可能(néng)會(huì)反應生(shēng)成一(yī)些對不鏽鋼有較大腐蝕性的産物(wù)，這種混合流動相(xiàng)應盡量不采用，或新鮮配制。此外，鹵代溶劑（如CH₂Cl₂）與一(yī)些反應性有機(jī)溶劑（如乙腈）混合靜(jìng)置時，還(hái)會(huì)産生(shēng)結晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配制使用。如果是和幹燥的飽和烷烴混合，則不會(huì)産生(shēng)類似問題。

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